IHC 简介
免疫组织化学（IHC）与免疫细胞化学（ICC）均为依托抗体特异性识别原理，实现特定抗原表达水平与定位可视化的经典实验技术。1941 年，Albert Coons 首次公开应用相关技术，成功在感染肺炎球菌的小鼠组织切片中，检测出肺炎球菌抗原，这也是 IHC 技术的首次正式应用。
从术语释义来看，IHC 由 “immuno-（抗体免疫）” 与 “histo-（组织）” 两个词根组成，对应其组织切片的检测样本体系；而 ICC 中的 “cyto-（细胞）” 词根，精准界定了两项技术的核心差异：IHC 的检测载体是完整组织切片，ICC 则以组织分离单细胞或体外培养细胞为检测样本。受样本类型差异影响，两项技术的前期样本制备流程存在一定区别，但后续核心实验操作流程基本一致，这也是科研场景中两项技术名称常被通用、互换的主要原因。两项技术的核心检测原理高度统一：均采用偶联了化学显色基团或荧光标记物（辣根过氧化物酶、罗丹明等）的特异性抗体，依靠抗原 - 抗体的精准特异性结合反应，标记并显现目标抗原的分布位置。
在实验观测层面，IHC 需先将组织制成薄层切片并固定于载玻片，最大程度保留原始组织结构，可依托完整的组织微环境，直观观察抗原在组织中的整体分布特征。而 ICC 无需制备组织切片，直接将分散的单细胞均匀铺片固定后染色，能够精准解析抗原在单个细胞内部的定位与表达情况，但无法体现抗原在机体固有组织结构中的分布规律。
IHC 样品准备
组织样本
动物或人体来源的组织，在材料选择时尽可能不损伤所需要的部分，动物组织取材建议灌流后取材，冲去过多血液。切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。切取的材料应该小而薄，约黄豆粒大小，便于固定剂迅速渗入内部。
石蜡包埋样本
石蜡包埋是组织样本长期保存的优选方案。组织包埋前必须完成固定，可于解剖后即刻采用灌注或者浸泡方式处理，固定时长一般为 4-24 h，不建议超过 24 h，过度固定会造成抗原表位掩蔽。固定完成后，若暂不包埋，组织可转移至酒精中存放。固定液的种类需要根据组织来决定。
石蜡不与水互溶，因此组织浸熔融石蜡前需要充分脱水：将组织依次浸泡于梯度升高浓度的乙醇，逐步改变样本疏水性，最大程度降低细胞损伤。脱水结束后，组织经二甲苯孵育去除残留乙醇。石蜡一般加热至 60 ℃ 用于包埋，放置过夜完成硬化。随后将组织切为超薄切片，贴附于载玻片，可于室温长期存放。开展 IHC/ICC 免疫染色前，切片需要进行复水处理。
冷冻样本
冷冻组织样本的一大优势是省去石蜡包埋所需的前期固定步骤，可节约实验时间。在检测磷酸化这类翻译后修饰靶点时，速冻处理尤为适用。冷冻组织可将组织浸入液氮、异戊烷，或埋置于干冰中完成制备。
冷冻样本一般在冷冻、切片完成后再进行短暂固定，多采用醇类（甲醇 / 乙醇）固定。与甲醛不同，醇类不会造成抗原表位掩蔽，因此无需后续抗原修复步骤。组织在低温恒温器内完成切片，切片置于 -80 ℃ 条件下可保存 1 年。
相比石蜡包埋样本，冷冻组织制备周期更短，但存在明显局限：样本无法实现超长期保存；冷冻过程形成的冰晶会损伤亚细胞结构；冷冻切片通常厚度偏大，降低显微成像分辨率。冷冻样本的重要应用价值在于能够保留酶活性，避免内源性酶干扰 IHC 实验结果。
细胞样本
在细胞免疫化学（ICC）实验体系中，需将待测细胞牢固粘附并固定于固相载体表面。目前实验中最常用的固相载体为无菌载玻片与盖玻片，是 ICC 实验的标准载体选择。根据细胞培养特性的不同，贴壁细胞与悬浮细胞的玻片粘附处理方式存在明显差异，具体操作规范如下。
贴壁细胞
针对贴壁细胞，可采用原位贴壁培养的方式实现细胞粘附：提前将无菌玻片平稳放置于细胞培养皿、培养板等培养底物中，随后接种细胞进行常规培养。经过一段时间的培养孵育，贴壁细胞会自主贴附、伸展并定植在玻片表面，自然形成稳定的细胞单层，满足后续 ICC 实验要求。对于粘附能力较弱的贴壁细胞，或实验对细胞粘附牢固度要求较高时，可提前对玻片进行包被预处理，强化细胞粘附效果。常用包被试剂分为两类，一类是带电聚合物，以多聚赖氨酸为代表，可通过电荷吸附作用增强玻片与细胞膜的结合能力；另一类是胞外基质蛋白，包括层粘连蛋白、纤维连接蛋白、胶原蛋白等，能够模拟体内细胞生长的微环境，最大程度提升细胞的贴壁效率与活性，同时减少细胞应激损伤。
悬浮细胞
针对无自主贴壁能力的悬浮细胞，无法通过自然培养实现玻片粘附，需借助外力辅助或试剂介导的方式完成粘附固定。主流处理方法有两种：一是离心粘附法，将制备好的细胞悬液均匀滴加在玻片上，通过低速离心的外力作用，使细胞均匀、紧密地沉降并吸附于玻片表面；二是试剂介导法，利用多聚赖氨酸对玻片进行预处理孵育 10 分钟，使玻片表面形成带电粘附层，随后加入悬浮细胞，依靠电荷吸附作用实现细胞的稳定粘附，该方法操作温和，可最大程度保留细胞形态与抗原完整性，适配大多数悬浮细胞的 ICC 样本制备需求。
完成细胞爬片贴壁后，后续的固定、通透、封闭、抗体孵育、洗涤等所有 ICC 实验步骤，均可将承载细胞的玻片置于微孔板内完成，操作便捷且能有效节约试剂、降低实验误差。
固定液选择
| 固定剂类型 | 固定原理 | 核心特点、优势与适用场景 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| 4% 甲醛 | 经典交联型固定剂，可与蛋白质氨基等基团发生反应，在蛋白质分子间形成化学桥键，锁定蛋白质空间结构，实现组织与细胞结构的稳定固定。 | 渗透能力强，组织固定均匀，样本收缩程度小；可完整保留绝大多数抗原结构，适用性广，是免疫组化、免疫荧光实验的核心常用固定剂。 | 对部分甲醛敏感抗原存在轻微掩蔽作用，部分样本需后续抗原修复处理。 |
| 10% 中性福尔马林（NBF） | 经磷酸盐缓冲体系调配的甲醛水溶液，pH 值稳定维持在中性区间，通过甲醛交联蛋白的核心原理实现组织固定。 | 规避了普通福尔马林久置变酸的问题，不会破坏抗原表位，可同时完美保存组织形态结构与抗原活性，稳定性极强，是常规病理组织切片制备的金标准固定液。 | 无明显短板，仅针对极少数特殊敏感靶点适配性有限。 |
| Bouin 固定剂 | 由苦味酸、甲醛、冰醋酸复配的混合固定剂：苦味酸沉淀蛋白质、浸染组织；甲醛交联固定蛋白；冰醋酸专一固定细胞核结构。 | 精细组织结构保存效果优异，细胞核染色质显色清晰、边界清晰；专门适配胚胎、睾丸、骨髓等精细脆弱组织的固定制片。 | 固定后组织收缩明显，组织会被染成黄色，后续染色实验前必须进行脱色处理，操作流程更繁琐。 |
| Zenker 溶液 | 含汞复合型固定剂，搭配冰醋酸组分，通过重金属沉淀、蛋白交联协同作用，高效固定结缔组织与细胞核结构。 | 对胶原纤维等结缔组织、细胞核固定效果极佳，样本染色对比度高、层次清晰，常用于肌肉组织、内分泌器官的病理检测。 | 含汞具有毒性，操作需严格防护；固定后组织质地变脆，易出现碎裂，不利于超薄切片。 |
| Helly 溶液 | Zenker 溶液改良型固定剂，以福尔马林替换原有冰醋酸，保留汞盐核心固定体系，优化组织成分适配性。 | 可完好保存红细胞、线粒体等脆弱结构，对富含血液的脏器适配性极强，适用于肝脏、脾脏、骨髓及各类血涂片样本固定。 | 含汞有毒，操作防护要求高，同样存在固定后组织偏脆的问题。 |
| Carnoy 溶液 | 由乙醇、冰醋酸、氯仿组成的非交联沉淀型固定剂，通过破坏蛋白水化层实现蛋白沉淀固定，无分子交联反应。 | 渗透速度极快，可瞬时固定细胞内部结构；对 DNA、RNA、糖原保存效果绝佳，能增强细胞核嗜碱性，提升染色清晰度，适用于细胞学涂片、核酸研究、糖原特异性染色实验。 | 固定力度较强，易造成轻微组织收缩，不适合对形态完整性要求极高的超微结构观察。 |
| 100% 冰冷丙酮 / 甲醇 | 有机溶剂类固定剂，通过破坏蛋白质表面水化层，改变蛋白空间构象，促使蛋白沉淀变性，完成细胞固定，无交联反应。 | 不产生抗原交联掩蔽效应，可完整保留甲醛敏感的大分子蛋白抗原（如免疫球蛋白）活性，适配特殊抗原的免疫检测实验。 | 必须低温环境使用，稳定性差；会破坏部分酶活性与细胞精细亚显微结构，样本保存时限有限。 |
| 锌福尔马林 | 在标准福尔马林体系中添加锌盐助剂，锌离子可与组织内蛋白质、核酸结合形成稳定复合物，辅助甲醛完成固定。 | 相较普通甲醛，细胞核精细形态保存更佳，染色质颗粒清晰、核仁分明；组织软硬适中、弹性良好，切片难度低，适配常规病理切片与染色实验。 | 对极少数特殊抗原的保护效果略低于专用固定剂，无明显硬性缺陷。 |
| 4% 甲醛 - 1% 戊二醛混合液 | 双交联剂复合体系，戊二醛为高活性双功能交联剂，交联强度远高于甲醛，二者结合兼顾结构固定与抗原保留效果。 | 超微结构保存能力顶尖，可精准保留细胞亚显微结构，同时留存部分抗原活性，是免疫电镜样本制备的首选固定剂组合。 | 交联作用较强，会掩蔽部分抗原表位，需针对性做抗原修复；整体渗透穿透力偏弱，厚组织固定均匀度有限。 |
IHC 抗原修复与透化
样本固定过程有时会导致蛋白交联折叠，从而遮蔽抗原表位，限制抗原 - 抗体的结合。一般通过热诱导抗原修复方法（HIER）和酶 / 蛋白水解抗原修复（PIER）方式进行修复。如果固定程度较轻，可能不需要进行抗原修复。例如，冷冻组织用酒精固定，则不需要进行抗原修复，因为酒精不会掩盖表位。
| 对比维度 | HIER（热诱导表位修复） | PIER（蛋白酶诱导表位修复） |
|---|---|---|
| 核心原理 | 通过高温热能水解甲醛固定形成的亚甲基交联键，同时使变性折叠的蛋白重新舒展，恢复抗原表位的天然空间构象 | 利用蛋白酶特异性切割肽键，消化遮蔽抗原表位的周边蛋白片段，解除交联带来的空间位阻，暴露抗体结合位点 |
| 作用方式 | 物理热效应 + 缓冲液化学环境协同，非破坏性恢复蛋白构象 | 生物酶解反应，通过蛋白部分消化移除遮蔽结构 |
| 常用体系 | 缓冲液： ・柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0，通用型） ・Tris-EDTA 缓冲液（pH 9.0，强修复型） ・Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0–10.0） 加热方式：水浴、高压灭菌锅、微波炉、蒸箱 | 常用酶： ・胰蛋白酶（pH 约 7.8，温和型） ・胃蛋白酶（酸性环境，强消化型） ・蛋白酶 K（广谱强消化） 辅助：透明质酸酶（胞外基质蛋白专用）、核酸酶（特定核抗原） |
| 标准操作条件 | 温度：95–100 ℃\n孵育时长：10–30 min\n后续：自然冷却至室温（20–30 min） | 温度：37 ℃ 恒温孵育\n孵育时长：5–30 min（依酶种类调整）\n后续：立即用缓冲液终止酶反应 |
| 组织形态保存 | 优秀：对组织架构和细胞细节破坏极小，能完整保留病理形态结构 | 波动大：消化适度时形态尚可；过度消化会导致组织侵蚀、细胞边界模糊、出现 “蜂窝状” 伪影，甚至切片脱落 |
| 背景染色风险 | 低：优化后非特异性染色少，柠檬酸盐缓冲液背景控制最佳 | 偏高：酶消化可能暴露组织内非特异性结合位点，易产生弥散性背景 |
| 核心优势 | 通用性强，适配绝大多数抗体 操作标准化程度高，结果稳定 组织形态保存好，兼容病理诊断 可一定程度抵消过度固定的负面影响 | 对高度交联、陈旧 FFPE 样本的特定抗原修复效果更优 无需高温设备，操作设备门槛低 针对胞外基质等特殊靶点不可替代 |
| 主要局限 | 碱性高 pH 缓冲液易导致组织脱片 极少数交联极强的抗原修复效果有限 加热不均可能造成切片修复强度不一致 | 消化过度会直接破坏靶抗原表位，导致信号丢失 对松散、脆弱组织（脑组织、造血组织）损伤风险高 条件摸索成本高，泛用性差 |
在选择修复方法时，优先选择 pH 6.0 柠檬酸盐 HIER，如果柠檬酸盐修复信号微弱，可更换为 pH 9.0 Tris-EDTA 缓冲液，或延长加热时间，仍无效再考虑 PIER。如果抗体说明书明确标注需酶修复（如部分胶原、免疫球蛋白抗体），直接采用对应 PIER 方案。如遇特殊情况，可尝试 HIER + 轻度 PIER 联合修复，先热修复打开交联，再短时间酶消化强化表位暴露。
透化
大部分石蜡 FFPE 切片不需要进行透化，冰冻切片与细胞 ICC 常需要透化。
常用透化剂有 Triton X-100、Tween-20、丙酮、甲醇；可根据切片及目的蛋白的性质进行选择。
封闭
封闭是 IHC 实验的关键步骤，封闭剂的选择也是多样的。
| 封闭剂类型 | Fc 受体封闭 | 磷酸化蛋白适用 | ABC 生物素体系适用 | 注意事项 |
|---|---|---|---|---|
| 同源血清 | 是 | 是 | 否 | 批次差大、成本较高 |
| BSA | 否 | 是 | 是 | 不能封闭 Fc 受体，免疫细胞多的切片需慎用 |
| 脱脂奶粉 | 否 | 否 | 否 | 成分较复杂，不可用于淋巴 / 脾脏组织 |
| 鱼明胶 | 否 | 是 | 是 | 溶解性一般，容易析出 |
抗体孵育
一抗孵育：除去切片上的封闭液，轻轻甩干或用吸水纸吸干残留液体，滴加用缓冲液 TBS 稀释的一抗工作液，覆盖整个组织切片，将切片水平放置于孵育湿盒中，置于 4 ℃ 孵育过夜。过夜后取出湿盒，室温静置复温，弃去一抗工作液，洗涤。
二抗孵育：滴加二抗工作液，将切片水平放置于孵育湿盒中，于 37 ℃ 恒温孵育 1 小时。弃去二抗工作液，洗涤。
DAB 显色：显色前 5 分钟，配置 DAB 显色工作液。在组织切片上滴加显色工作液，显微镜下密切观察颜色变化（通常 10-60 秒即可得到合适的染色强度）。达到理想染色强度后，立即将切片浸入大量去离子水中终止显色。
复染与返蓝：将切片浸入 Mayer’s 苏木素中复染，用自来水冲洗切片 10 分钟，使细胞核返蓝。
脱水、透明与封片步骤
梯度脱水：将染色好的切片依次通过不同浓度的乙醇进行梯度脱水。
切片干燥：将切片置于恒温箱（55 ℃ - 60 ℃）或恒温台上，直至切片完全干燥、透明。
封片：在切片组织中心滴加适量中性树脂（中性树胶），小心加盖盖玻片，避免产生气泡，待中性树脂干透后即可阅片或保存。
